病理組織包埋

　　病理組織包埋染色俗稱HE 染色法為蘇木精-伊紅染色法，是石蠟切片技術(shù)里常用的染色法之一，也是組織學(xué)、胚胎學(xué)、病理學(xué)教學(xué)與科研中基礎(chǔ)、廣泛的技術(shù)方法。

　　屬性為堿性的蘇木素染色液可以使細(xì)胞著藍(lán)色，為酸性的伊紅使細(xì)胞著紅色，其結(jié)果胞核呈藍(lán)色，胞漿呈紅色。兩種不同的染色液使細(xì)胞通過顏色來(lái)改變折光率，在光鏡下呈現(xiàn)出細(xì)胞圖像。

　　病理組織包埋染色之所以成為細(xì)胞染色常用的方法是因?yàn)镠E染色法過程中除化學(xué)反應(yīng)外，還有物理作用中吸附、吸收效果，使HE染色提供良好的核漿對(duì)比染色效果。

　　若細(xì)胞用4％多聚甲醛固定，則染色時(shí)間相應(yīng)延長(zhǎng)，蘇木素染色12-15min，伊紅5min即可。

　　6、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、鑷子、蓋玻片、載玻片、顯微鏡。

　　病理組織包埋染色常見規(guī)格為310ml和3100lm。

    　2、蘇木精溶液染色：

　　(5)蒸餾水過洗 5 s 

　　(2) 蒸餾水稍洗 30 s

　　(8)中性樹膠封固

　　著色深淺與組織或細(xì)胞的種類有關(guān)，也隨其生活周期及病理變化而改變。例如，細(xì)胞在新生時(shí)期胞漿對(duì)伊紅著色較淡或輕度嗜堿，當(dāng)其衰老時(shí)或發(fā)生退行性變則呈現(xiàn)嗜伊紅濃染。膠原纖維在老化和出現(xiàn)透明變性時(shí)，伊紅著色由淺變深。

病理組織包埋染色全組織包埋免疫熒光染色

　　另取5只小鼠經(jīng)水合氯醛麻醉后，建立跨區(qū)耳瓣模型，方法同前。在建模后第3天處死小鼠，脫毛液盡量去除小鼠耳部毛發(fā)，將耳瓣側(cè)耳部剪下，利用生理鹽水洗凈，在光學(xué)放大體式顯微鏡下使用剪刀和鑷子進(jìn)一步去除毛發(fā)。接著按照以下步驟進(jìn)行組織處理：（1）將剪下的小鼠耳放入裝有甲醇的EP管中，沉至管底，-20 ℃保存至少30 min；（2）取出鼠耳，放入裝有Hanks平衡鹽液的培養(yǎng)皿中，在體式顯微鏡下利用鑷子緩慢分離，將耳組織分為前層皮膚、軟骨及后層皮膚，將分離出的前層皮膚放入裝有4%的多聚甲醛的EP管中，4 ℃固定1 h直至組織沉淀至管底；（3）取出前層皮膚，放入1×PBS中洗滌3次，每次5 min；（4）取出洗滌后的前層皮膚，置于裝有1×PBS緩沖液的培養(yǎng)皿中，在光學(xué)放大體式顯微鏡下使用剪刀和鑷子剔除多余的脂肪結(jié)締組織，進(jìn)行精修。

　　對(duì)建立跨區(qū)耳瓣模型第3 d的鼠耳進(jìn)行全組織包埋免疫熒光染色，觀察跨區(qū)耳瓣模型建立3 d后，跨區(qū)耳瓣choke區(qū)域小血管及毛細(xì)血管的管徑大小，末梢神經(jīng)走行以及與血管再生相關(guān)的單核巨噬細(xì)胞［4］分布情況。CD31與α-SMA抗體分別對(duì)血管內(nèi)皮與血管平滑肌進(jìn)行染色，利用Tuj1及α-SMA對(duì)軸突與血管分別進(jìn)行標(biāo)志，利用CD68抗體進(jìn)行單核巨噬細(xì)胞染色。具體操作步驟如下：（1）制備封閉液（簡(jiǎn)稱10%HIGS），將10 ml山羊血清、0.2 ml曲拉通X-100溶于100 ml磷酸鹽緩沖液中,并應(yīng)用0.45 μm的濾器對(duì)配成的溶液進(jìn)行濾過。（2）在室溫條件下，將處理完的鼠耳前層皮膚放入裝有1 ml 10% HISG的24孔板中，搖床輔助孵育30 min。（3）制備一抗溶液，使用10%HIGS稀釋一抗，稀釋比例1∶500。將CD31、CD68、α-SMA、Tuj1一抗同時(shí)稀釋混合使用，孵育時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)可加入0.2%抑菌防腐。（4）將經(jīng)孵育的皮膚取出放入新孔或用滴管吸除10%HIGS溶液后，加入150 μm一抗溶液，4 ℃搖床孵育過夜，第2天將皮膚轉(zhuǎn)移至新孔洞或用滴管吸除原有溶液，加入1 ml 2%HIGS溶液，室溫下?lián)u床洗脫一抗3次，每次15 min，每次洗脫更換液體。（5）制備二抗溶液，使用10%HIGS稀釋二抗，稀釋比例1∶500，將CD31、CD68、α-SMA、Tuj1二抗同時(shí)稀釋混合使用，通過0.22 μm的生物濾膜對(duì)配成的液體進(jìn)行過濾。13 000 g離心二抗溶液，離心5 min。（6）將洗脫后的皮膚取出，放入新孔洞或用滴管吸除原有溶液，加入150 μm二抗溶液，室溫下?lián)u床孵育1 h，避光。（7）取出皮膚，將皮膚轉(zhuǎn)移至新孔洞，加入1 ml 2%HIGS溶液。室溫下，搖床洗脫二抗3次，每次15 min，每次洗脫更換液體。（8）取出皮膚，轉(zhuǎn)移至新孔洞，加入150 μm DAPI (1∶1000) 溶液染色，孵育10 min。（9）取出皮膚，轉(zhuǎn)移至新孔洞，加入1 ml 2%HIGS溶液。室溫下，搖床洗脫3次，每次15 min，每次洗脫更換液體。（10）把組織樣本放入載玻片上鋪平，滴加1滴熒光封片劑，封蓋蓋玻片,放于室溫過夜，待熒光封片劑凝固，于共聚焦激光顯微鏡下掃描觀察。

此產(chǎn)品只用于科研，不作用于人體

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